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高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸熒光PCR檢測
高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸熒光PCR檢測
更新時間:2025-02-18
訪問量: 3334
廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家

高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸熒光PCR檢測試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時熒光PCR技術(shù),是針對豬藍(lán)耳病毒設(shè)計(jì)的檢測體系,用于豬血清和組織等樣本的檢測。

高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸熒光PCR檢測產(chǎn)品概述:

高致病性豬藍(lán)耳病病毒核酸熒光PCR檢測試劑盒

 

                   

前言

本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時熒光PCR技術(shù),是針對豬藍(lán)耳病毒設(shè)計(jì)的檢測體系,用于豬血清和組織等樣本的檢測。

 

試劑盒組成成分

組成成份(48Tests/kit

規(guī)格

核酸擴(kuò)增試劑

 

RT-PCR反應(yīng)液

994.5µl×1

Taq(5U/µl)

15.5µl×1

Enhancer

10.5µl×1

對照品

 

陰性對照

25µl×1

陽性對照

25µl×1

 

儲存條件及有效期

本試劑盒貯存于-20℃的條件下有效期為6個月。

 適用儀器(熒光PCR檢測儀)

Ø  ABI公司Prism7000、7300、7500系列

Ø  RotorGene系列

 

Ø  Bio-Rad公司的iCycler系列

【自備試劑】

核酸提取試劑。

【樣本采集、存放及運(yùn)輸】

1.樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集。

2.存放:分離后的血清或血漿樣本在2—8℃條件下保存應(yīng)不超過72h-70℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(多凍融3次)。

3.運(yùn)輸:采用冰hu或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

【檢驗(yàn)方法】

1.樣本處理(樣本處理區(qū)):

用戶可采用病毒RNA提取試劑盒提取RNA用于檢測或保存與-20℃(-80℃更佳)以待檢測。說明:陽性對照及陰性對照無需提取,直接上樣。

2.擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(PCR前準(zhǔn)備區(qū)):

從試劑盒中取出RT-PCR 反應(yīng)液、Taq酶及PCR Enhancer,室溫融化并振蕩混勻后,2000rpm離心10秒。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為nn = 樣本數(shù) + 1管陰性對照 + 1管陽性對照),每個測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

RT-PCR反應(yīng)液

Taq

PCR enchancer

用量

19.5 µl

0.3ul

0.2 µl

計(jì)算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積離心管中,充分混合均勻,2000rpm離心10秒,向設(shè)定的nPCR反應(yīng)管中分別加入20 µl,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

3.加樣(樣本處理區(qū)):

向所設(shè)定的nPCR 反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA、陰性對照和陽性對照各5µl,蓋緊管蓋,轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。將PCR反應(yīng)管排好放入PCR儀內(nèi),記錄樣本擺放順序。

4.PCR擴(kuò)增(檢測區(qū))

4.1       循環(huán)條件設(shè)置

50℃:30 min;

95℃:3 min;

95℃:10 sec, 60: 1min  40個循環(huán)。

熒光信號收集設(shè)在60℃。反應(yīng)體系設(shè)為25ul。

4.2       儀器檢測通道選擇

待測熒光為FAM熒光素,熒光PCR檢測儀熒光信號收集設(shè)定為FAM熒光素。

5.結(jié)果分析條件設(shè)定:

5.1       閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線(無規(guī)則的噪音線)的高點(diǎn)為準(zhǔn)。

5.2       基線(baseline)應(yīng)選擇該次實(shí)驗(yàn)指數(shù)擴(kuò)增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域(所有樣本熒光信號無較大波動),起始點(diǎn)(循環(huán)數(shù))應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號波動,終止點(diǎn)(循環(huán)數(shù))應(yīng)比早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的樣本Ct值減少1-2個循環(huán)。

注:具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn):

陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性;

 

陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于32.0。

1.結(jié)果判斷:

Ø Ct值無讀數(shù)的樣本為陰性。

Ø Ct≤38.0的樣本為陽性。

Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。

重做結(jié)果Ct值<40.0為陽性,否則為陰性。

【試劑盒使用注意事項(xiàng)】

1. 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2. 本試劑盒僅用于體外檢測。

3. 實(shí)驗(yàn)請嚴(yán)格分區(qū)操作:

*區(qū):PCR前準(zhǔn)備區(qū)——準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑;

第二區(qū):樣本處理區(qū)——待測樣本和對照品處理;

第三區(qū):檢測區(qū)——PCR擴(kuò)增檢測。

4. 各區(qū)物品均為,不得交叉使用,避免污染,實(shí)驗(yàn)后即請清潔工作臺。

5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前,充分融化后請稍事離心。

6. 在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物,應(yīng)在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。

7. 分裝有反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)扣蓋或裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。

8. 加樣時應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中,不應(yīng)有樣品粘附于管壁上,加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。

9. 擴(kuò)增完畢立即取出反應(yīng)管,密封在塑料袋內(nèi),丟棄于地點(diǎn)。

10. 反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

11. 實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi),并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

12. 工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。

1.結(jié)果判斷:

Ø Ct值無讀數(shù)的樣本為陰性。

Ø Ct≤38.0的樣本為陽性。

Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。

重做結(jié)果Ct值<40.0為陽性,否則為陰性。

【試劑盒使用注意事項(xiàng)】

1. 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2. 本試劑盒僅用于體外檢測。

3. 實(shí)驗(yàn)請嚴(yán)格分區(qū)操作:

*區(qū):PCR前準(zhǔn)備區(qū)——準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑;

第二區(qū):樣本處理區(qū)——待測樣本和對照品處理;

第三區(qū):檢測區(qū)——PCR擴(kuò)增檢測。

4. 各區(qū)物品均為,不得交叉使用,避免污染,實(shí)驗(yàn)后即請清潔工作臺。

5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前,充分融化后請稍事離心。

6. 在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物,應(yīng)在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。

7. 分裝有反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)扣蓋或裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。

8. 加樣時應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中,不應(yīng)有樣品粘附于管壁上,加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。

9. 擴(kuò)增完畢立即取出反應(yīng)管,密封在塑料袋內(nèi),丟棄于地點(diǎn)。

10. 反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

 

11. 實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi),并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

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